间充质干细胞培养实验方案

细胞生物学专家 201812月18

 

一、目的:利用间充质干细胞无血清培养基培养分离脐带间充质干细胞。

二、材料:新生儿脐带

三、主要仪器:医用手术器械,生物安全柜,CO2培养箱,6孔培养板,T25培养瓶

四、试剂:

1 MSC NutriStem® XF Medium

2 建议选用试剂 


 

五、实验前准备:

5.1完全培养基的准备

5.1.1冻存的MSC NutriStem® XF Supplement在室温或2-8℃解冻,避免反复冻融。

5.1.2 配制:MSC NutriStem® XF Basal Medium(培养基) :MSC NutriStem® XF

Supplement(添加物):青链双抗=500ml3ml5ml4℃保存,2周内使用。

1:双抗非必须,建议原代(P0)时使用。

2:培养基含L-Glutamine,贮藏时避免长期照光。

 

5.2包被培养皿

或跳过此步骤,直接加2%血小板裂解物,促进MSC细胞贴壁与生长。

5.2.1使用DPBS溶液(货号:02-023-1A),将MSC贴壁试剂稀释100倍(1:100)。

5.2.2参照表3,加入适量的1X MSC贴壁试剂涂层培养皿或板。

3  涂层过程中贴壁试剂建议使用量

1:涂层的培养皿需在无菌条件下2℃-8℃储存,需在一周内使用。 (标示红色为原厂建议使用量,经过实验测试后可减半使用) 

2:包被期间, 注意包被液不可以干掉!

3:若使用预包被培养瓶(Corning CellBind 系列,或NEST TC处理系列), 步骤

5.2的包被可略过。

 

5.2.3 轻轻摇动培养皿,确认贴壁试剂均匀分布在培养皿表面后,用封口膜包裹涂层的培养皿。

5.2.42-8℃孵育过夜;或者在CO2培养箱,37℃,至少孵育30分钟。

5.2.5接种前, 吸除贴壁试剂,再用DPBS轻轻冲洗培养皿,即可接种细胞。

 

5.3制备1X大豆胰酶抑制剂

5.3.1使用无菌的DPBS,将50X大豆胰酶抑制剂(03-048-1C)稀释成1X

 

六、使用范例:

6.1 UC-MSC原代培养 (组织块法)

6.1.1无菌条件下取新鲜脐带,用DPBS漂洗净血迹

* 一般脐带取得非无菌环境,可以稍微用75%酒精润洗。

6.1.210cm 培养皿中,剪成1~2cm脐段,剔除血管,用DPBS洗净血迹,再剪成1mm3组织块。( 1)

6.1.3用无菌滴管吸取少量细小组织块均匀散布在 6 孔板 2 个孔中。

6.1.4 37℃5%CO2培养箱孵育 30min,以使组织块粘贴在培养皿壁上。

6.1.5 向每孔滴加0.8ml 完全培养基 (注意沿孔壁小心滴加,勿使冲动组织块)

6.1.6 37℃5% CO2 培养箱孵育过夜,次日 (D1) 每孔再补加1ml 完全培养基。

6.1.7 37℃5% CO2 继续培养,5 (D6) 后半量换液 (此时一般看不到细胞,但最快3天就可看到细胞从组织边沿爬出)

6.1.8再过5天后半量换液 (此时一般会有细胞爬出,但最晚可到14天会出现细胞从组织边沿爬出) (2、图3)

6.1.92天换一次培养液,继续培养2~4天,待细胞融合度(Confluency)达到约80%后传代培养(4)

1:组织块培养的关键是要保障组织块始终贴壁,换液动作要尽可能轻微,避免冲动组织块。培养基加量不能太多,以免组织块漂浮。

2:为增加成功率,从原代分离脐带和脂肪间充质干细胞, 培养基可加2.5%的人 AB (AB 型血清必须除菌过滤,且 HbsAG HCV/HIV 抗体阴性)

 

6.2 UC-MSC原代培养 (消化法)

MSC NutriStem® XF Medium也能有效地培养消化法取得的原代细胞,操做方式可依各实验室的实验步骤,或参考上海逍鹏MSC ACF Tissue Digestive Mix (货号:C35010010) 的使用说明。

6.2.1 将脐带用DPBS漂洗干净,剪成1-2cm,后剔除血管。

* 一般脐带取得非无菌环境,可以稍微用75%酒精润洗。

6.2.2将组织剪成3-5mm3后,移入50ml离心管,再加入的分离液。

* 一条长度10公分的脐带建议加入10ml的分离液;或者组织块 : 分离液(vol= 1:1

** 视情况而定,可自行在分离液中添加1%青链双抗(BI, Cat# 03-031-1B)

6.2.350ml离心管横放在37度细胞培养箱,过夜反应(16小时)。

* 若总反应体积较大,也可持续旋转混合。

6.2.4加入和分离液等体积的0.05%EDTABI, Cat#03-015-1B)终止反应后,1500 xg 离心5分钟,去除上清。

* 溶液比较浓稠,小心不要影响下层的细胞;建议留下5ml左右的溶液。

** 若是脂肪组织,没有粘稠的情形,以常规的200-300 xg离心即可。

*** 没有EDTA, 可使用无钙镁DPBS取代;此时建议后面步骤6多重复2-3次,以确实去除酵素。

6.2.5以和分离液等体积的无钙镁DPBS重悬细胞后,500 xg离心5分钟,去除上清。

6.2.6再次以和分离液等体积的无钙镁DPBS重悬细胞后,250 xg离心5分钟,去除上清。

6.2.7用适量的培养基重悬细胞后,即可按常规细胞培养方法接种P0 代细胞培养。

* 消化后的原代细胞,建议培养时接种密度提高到10,000/cm2以上;传代后即可按常规的接种密度培养。

6.3 UC-MSC传代培养与冻存

6.3.1 待细胞融和度达到约 80%后进行传代(细胞不能太密集,否则容易分化) ,吸弃传代板孔中的培养基,每孔加适量DPBS轻轻冲洗1次。

6.3.2根据培养皿适量加入重组胰酶-EDTA(货号:03-079-1BT25建议使用1ml),在37℃5% CO2培养箱作用3~5 min(可轻拍培养瓶帮助细胞脱落) 。

6.3.3显微镜下观察细胞完全脱落后, 根据重组胰酶-EDTA使用量加入10倍体积的大豆胰酶抑制剂(1X) ,1000rpm 离心 3~5min。例:用 1ml 重组胰酶-EDTA,则加入 10ml大豆胰酶抑制剂(1X)与细胞混和均匀,再离心。

6.3.4谨慎吸出上清,细胞团块用适当体积的完全培养基悬浮后,混匀细胞悬液。

6.3.5 按照所需的比例进行传代或按照 5000-6000cells/cm2 的细胞密度将细胞接种至培养器皿中,放入37℃, 5% CO2培养箱内培养。

6.3.6 2-3 天更换一次培养基,待细胞融合度达到 80%左右时,参照操作步骤

6.3.1~6.3.5做细胞传代;或者参照操作步骤6.3.1~6.3.3收获细胞冻存。

6.3.7 细胞冻存:将细胞团块悬浮于适量 (0.5~1×106cells/ml) MSC 冻存液(货号:

05-712-1D)中,装入冻存管,2~8℃冰箱放置30min-80℃冰箱放置 24h,转入液氮罐冻存。

注:本方法仅供参考,用户可根据自身经验做合理调整。

附图:(如下是组织块法,建议客户可以尝试消化法)

   

      图1剔除脐带3根动静脉血管            2细胞从组织块边沿爬出

  

   

               图3细胞快速增殖               4传代时机成熟 (15天左右)