staurosporine诱导的细胞凋亡
 
细胞生物学专家 2018年12月25日
 
标签: staurosporine 诱导 细胞凋亡
 
Staurosporine是蛋白激酶C和其他大部分激酶(包括酪氨酸蛋白激酶)强有力的抑制剂。通过阻断磷酸二酯键从DNA转移到活化的酪氨酸位点而直接抑制拓普异构酶II的活性。可用于诱导CHO细胞凋亡。
 
 
staurosporine诱导小鼠心肌细胞凋亡模型构建
实验方法原理 Staurosporine是蛋白激酶C和其他大部分激酶(包括酪氨酸蛋白激酶)强有力的抑制剂。通过阻断磷酸二酯键从DNA转移到活化的酪氨酸位点而直接抑制拓普异构酶II的活性。可用于诱导CHO细胞凋亡。
实验材料: 妊娠的C57BL 6cr小鼠
试剂、试剂盒: staurosporine蒸馏水脱氢酶ZVAD-fmkLDH试剂盒Caspase3试剂盒胶原酶Ⅱ醌氯化钡细胞计数试剂盒STSTrypsinEDTA DIDSNPPB
仪器、耗材: 显微镜试管离心管移液枪离心管盒冰盒冰箱培养箱离心机载玻片盖玻片
 
实验步骤:
一、原代心肌细胞的培养及实验方案
 
 
1. 取出生后0~24 h C57BL/6cr小鼠心脏,按改良的Lader方法进行细胞的分离。 获取博动的心脏迅速放置于无Ca2+、Mg2+的Hank’s平衡液中。
 
 
 
2. 剪碎心脏,放置在4℃条件下100 g/L的Trypsin溶液中消化16~18 h,用Trypsin抑制剂中止消化。
 
 
 
3. 然后在37℃下,用胶原酶Ⅱ于CO2培养箱内,在摇床上继续孵化消化45~60 min。
 
 
 
4. 最后用70 μm直径尼龙过滤网过滤获取心肌细胞,用含有25 mmol/L HCO3-,100 mL/L FSB,1×105 u/L青霉素G和50 g/L链霉素的M199培养基制成细胞悬液,按差速贴壁分离法纯化心肌细胞。
 
 
 
5. 加入10 μmol/L BrdU到细胞悬液,以6×105密度种植于96或24孔细胞培养板上,置37℃培养箱培养。
 
 
 
6. 培养的心肌细胞24 h后更换含有10 μmol/L BrdU新鲜M199培养基,培养72 h后进行实验使用。
 
 
 
7. 设立阴性、阳性对照及实验组,每组20孔;阳性对照加入4 μmol/L STS,实验组中加入4 μmol/L STS后再分别加入250 μmol/L DIDS或100 μmol/L NPPB,100 μmol/L Quinine和1 mmol/L BaCl2孵化4 h,更换新鲜M199培养基继续孵化4 h后进行各种指标的检测。
 
 
 
二、细胞存活试验
 
 
 
1. 按照实验方案处理后的培养心肌细胞,每100 μL培养基的小孔中加入10 μL的MTT再孵化2 h,用分光比色仪进行检测,实验结果以细胞存活率表示,细胞存活率=A试验组/A对照组×100%。MTT法A值既能反映心肌细胞内线粒体脱氢酶活性,又能间接反映心肌细胞的增殖与存活情况。
 
 
 
三、凋亡琼脂糖凝胶电泳检测
 
 
 
1. 收集24孔板处理过的细胞,弃上清加入50 μL含有200 mg/L的RNase细胞裂解液(10 μmol/L Tris.HCl,0.1 mol/L EDTA,5 g/L SDS),37℃孵化1 h再加入500 mg/L蛋白酶K继续孵化。
 
 
 
2. 1 h后加入等体积的酚、氯仿、异丙醇(25∶24∶1)充分摇匀,离心取上清再加入等体积的氯仿抽提1次,转移的上清液中再加1/10体积3 mol/L醋酸钠及两倍体积的无水乙醇过夜后离心,700 mL/L的乙醇洗涤后,TE液溶解DNA,于20 g/L含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶中电泳,紫外透射仪下观察、记录拍照。
 
 
 
三、Caspase3活性的检测
 
 
 
使用ApoONETM Homogeneous Caspase3试剂盒检测Caspase3活性。实验设立空白、阴性对照及实验组,含有100 μL培养基的实验细胞中,加入100 μL的混合Caspase3底物ZDEVDR110和缓冲液,在室温下轻微摇动孵化6~8 h,用荧光检测仪于激发波为485 nm,散发波长538 nm处,读取检测荧光值.
 
 
 
四、心肌细胞膜完整性检测
 
细胞培养上清乳酸脱氢酶(LDH)活性检测,LDH能催化乳酸生成丙酮酸,丙酮酸与2,4二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙,在碱性溶液中呈棕红色,通过比色可求出酶活力。取细胞培养上清50 μL,反应后490 nm处测A值。
 
 
注意事项:
 
1. 严格进行消毒.使用三套器械取材。
 
 
 
2. 严格进行无菌操作,防止细菌、真菌、支原体污染,避免化学物质污染。
 
 
 
3. 吸取液体前,瓶口和吸管进行火焰消毒;经火焰消毒后的吸管一定要用Hank’S液冷却。防止烫伤、烫死细胞。吸取液体时,避免瓶口和吸管接触碰撞。
 
 
 
4. 离心管入台前,管口、管壁应消毒。




本文转自丁香园