细胞增殖检测
细胞生物学专家 2018年12月18日
标签: 细胞增殖 检测 同位素 BrdU
 
树突状细胞(DC) 是一组分布广泛的、由骨髓来源的、具有迁移能力的免疫细胞,是目前发现的功能最强大的抗原递呈细胞(APC)。 DC 是机体适应性 T 细胞免疫应答的始动者,主
 
要在(1)肿瘤免疫反应(2)在疫苗生产过程中分别起着至关重要的作用。
 
细胞增殖检测:3H同位素渗入法实例
 
实验方法原理 树突状细胞(DC) 是一组分布广泛的、由骨髓来源的、具有迁移能力的免疫细胞。体外培养的细胞分化能力并为完全丧失,只是环境的改变。
 
实验材料:血细胞、淋巴细胞。
试剂、试剂盒:RPMI-1640、 细胞培养液、2-巯基乙醇、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A、Hank's液、PBS缓冲液、3H-TdR。
仪器、耗材:筛网、96孔培养板、手术器械、二氧化碳培养箱、超净工作台、液体闪烁仪、多头细胞取集器、49型玻
璃纤维滤纸。
 
实验步骤
 
1. 外周血单个核细胞的采集
(1) 用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞 80 - 100ml;
(2) 淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)。
(3) 无血清培养液洗涤 2 次,获得纯度在 90%以上的 PBMC,细胞数量需达到 1-3 x108
 
2. 肿瘤抗原的制备
(1) 手术切除肿瘤标本,无菌条件下,将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净;
(2) 无菌生理盐水洗 3 次;
(3) 用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎,加入 RPMI 1640 培养基,充分研磨;
(4) 200 目无菌网过滤后收集单细胞悬液;
(5)用 RPMI 1640 培养基重悬细胞至 1-2 x107/ml,装入 5ml 无菌冻存管中;
(6)将冻存管浸入液氮中速冻,10 min 后取出,再迅速放入 37℃ 水浴中解冻 10 min。反复 3-5 次;(注:也可以-80℃/37℃ 反复冻融 3-5 次。)
(7) 将肿瘤裂解物加入离心管中,3000rpm,离心 10min;
(8) 收集上清,0.22μm 滤膜过滤除菌,留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体;
(9) -80℃保存备用。
 
3. DC细胞的培养
(1)步骤 1 中获得的 PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至 2 x106/ml,置于培养瓶内;
(2)37℃,5% CO2 培养箱中孵育 2h,以使单核细胞贴壁;
(3)洗去悬浮细胞,在贴壁细胞中加入含重组人 GM-CSF(500-1,000U/ml)和重组人 IL-4(500U/ml)的无血清培养液,37℃,5%CO2培养箱中培养,诱导单核细胞向 DC 细胞分化;
(4) 每 2-3d 半量换液一次,并补足细胞因子;
(5)(可选步骤) 在培养的第 5d, 加入步骤 2 中获得的肿瘤抗原 50 μg/ml,对 DC 进行抗原负载;(注:若不对 DC 进行抗原负载,该步省略。)
(6)在培养的第 6d,加入重组人 TNF-α(10ng/ml),IL-1β(10ng/ml),IL-6(1000U/ml)和PGE2(1μg/ml),诱导 DC 细胞成熟;
(7) 在培养的第 7d 或第 8d,收获 DC 细胞,其数量应达到 1×106个以上;
(8)DC 的质检:
   ① 活细胞比例:台盼蓝染色验证活细胞应在 90%以上;
   ② 形态学观察:>90%细胞半悬浮,细胞有多个树突样突起;
 
注意事项:
1. DC来源广泛,对实验的结果影响很大,来源包括,外周血单核细胞(Monocyte)、脐带血 CD34+细胞、骨髓和胎肝等,但因外周血单核细胞最容易获取、数量也最多,所以临床上被广泛用作 DC 的来源细胞。
 
2. DC 的成熟度两种,即 iDC 和 mDC,而 DC 的抗原递呈能力与其成熟状态密切相关。iDC 的抗原摄取和加工能力较强,但抗原递呈能力很弱。在体外培养时,iDC 去除细胞因子
 
(即 GM-CSF 和 IL-4)后,会逆转为巨噬细胞,且即使在细胞因子的维持下,未成熟 DC 的功能也不是激活 T 细胞,而是抑制 T 细胞的增殖。mDC 则正好相反,其抗原摄取和加
 
工能力很弱,但具有很强的抗原递呈能力。因而可以激活 T 细胞,引起免疫反应。而且 DC 成熟后即使在培养体系中去除细胞因子,仍能保持 DC 的状态和功能,不会发生逆转。
 
因此可以看出,DC 必须完全成熟后才能用于免疫治疗。
 
3.树突细胞的观察:树突细胞的观察需要借助透射电镜,透射电镜可见DCs伸展的突起,扫描电镜还可以拍摄到DC正在捕捉凋亡小体。
 
 
其他
1. 从 DC 的祖细胞(如单核细胞)诱导分化为未成熟 DC:IL-4 在由单核细胞诱导成 DC 的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长,从而引导单核细胞向 DC 方向分化。 
 
若培养体系中不加 IL-4,单核细胞将分化为巨噬细胞。同时,IL-4 还有降低细胞表面表达 CD14 分子的能力。CD14 表达水平的降低是单核细胞分化为 DC 的重要标志。
 
2. 从 iDC 诱导分化为成熟 DC :TNF- ,IL-1 和 IL-6 均为促炎症因子,在感染局部和肿瘤部位被诱导产生。体外研究表明,这 3 种细胞因子均可下调未成熟 DC 的巨胞饮作用
 
和表面 Fc 受体的表达,使细胞内 MHC II 类分子区室(class II compartment)消失,但能够上调细胞表面 MHC I类、II 类分子和 B7 家族分子(CD80, CD86 等)的表达, 使
 
未成熟 DC 分化为成熟 DC,此时 DC 的抗原摄取和加工能力明显减弱,而抗原递呈能力显著增强,可极强地激活 T细胞。TNF- IL-1 IL-6 三因子组合可在无牛血清培养条件下诱
 
导 DC 的完全成熟,从而制备出可以应用于临床的 DC。
 
3. 树突细胞的提呈抗原的方法主要有①抗原多肽刺激的DCs②酸提抗原刺激的DCs③肿瘤抗原编码基因导入DCs④肿瘤mRNA刺激的DCs⑤细胞因子基因修饰DCs及其与肿瘤细胞融合。
 
 
 
 
本文转自丁香园