大鼠乳鼠成骨细胞培养实验
 
细胞生物学专家 2019年2月13日
 
标签: 大鼠 乳鼠 成骨细胞
 
大鼠乳鼠成骨细胞培养培养用于:(1)获得大鼠乳鼠成骨细胞;(2)骨修复的细胞学机制研究。
 
酶消化法
 
实验方法原理
取材于出生2~3 d 小鼠颅骨,以含20%胎牛血清的DMEM培养液进行培养,采用胶原酶消化法分离成骨细胞,并进行细胞接种与传代。采用胶原酶消化法分离培养成骨细胞是一种可靠、简便、快速的细胞原代分离培养方法。
 
实验材料 :SD大鼠
试剂、试剂盒 :F12 完全培养液胰蛋白酶Ⅱ型胶原酶酒精
仪器、耗材 :手术器械磁力搅拌器
 
实验步骤
一、实验步骤
 
1.  拉颈处死24 小时内新生的SD大鼠,75%乙醇浸泡5 min,取出头盖骨,分离顶骨和额骨,冰生理盐水液反复洗涤大鼠乳鼠颅盖骨标本除去脂肪组织及残留血,放入另一盛有F12 完全培基液的培养皿中再洗涤, 将颅骨剪成2~5 mm2 碎片,将洗涤过的骨碎片用 0.25%胰蛋白酶2 ml 预消化15 min,以清除纤维组织细胞,弃去上清液(其中主要含成纤维细胞)。
2.  然后以0.1%  Ⅱ型胶原酶10 ml,在37℃环境中消化 20 分钟,室温下磁力搅拌消化20 分钟。静置数分钟,收集消化液,室温下以1200 rpm离心10 分钟。去除上清液,用20% 胎牛血清的F12 培养液4 ml 悬 浮细胞,接种于75 ml 培养瓶中,补培养液8 ml 使每瓶液体量达到12 ml;对静置后沉淀部分可再重复以胶原酶消化20 分钟、磁力搅拌消化15 分钟、离心10 分钟,将获得的3 瓶细胞放置于二氧化碳培养箱,在5% CO2,95%空气,37℃温度下培养,24 小时后可见细胞贴壁生长,胞质开始伸展,换新鲜培养液,以后每隔48 小时换培养液(注:消化视具体情况而定,也可多消化 1 遍)。
3.  原代培养一般接种后第7 天能长满。传代时,取生长良好、贴壁松紧适度的成骨细胞 1 瓶,弃去培养 液,传代时先以 PBS 冲洗 2 遍,加 0.25%胰酶1 ml,室温下消化3~5 分钟,将胰蛋白酶液弃去,加 F12 培养液充分吹打8-10 分钟。将已消化的细胞收集、合并,计数;用 F12 完全培基调节至细胞浓度为合适浓 度。一般取2-5 代成骨细胞进行实验。代数太多,细胞老化或者分化明显。
 
二、结果
如图所示,成骨细胞的形状和成纤维细胞非常相似,但是不同的是,比成纤维细胞更不容易消化,尤 其是传代次数多,细胞老化的时候,非常难消化,并且不易消化成单个细胞。
 
图1:成骨细胞
图2:成骨细胞100倍
图3:成骨细胞形成的矿化结节
三、鉴定的方法
1.  碱性磷酸酶(ALP)活性检测
2.  骨玻璃样蛋白(BGP)检测
3.  矿化结节检测
 
注意事项
1. 自取材开始,保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。
2. 在超净台中,组织细胞、培养液等不能暴露过久,以免溶液蒸发。
3. 凡在超净台外操作的步骤,各器皿需用盖子或橡皮塞盖住,以防止细菌落入。
4. 操作前要洗手,进入超净工作台后要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦拭手。试剂瓶口也要擦拭。
5. 点燃酒精灯,操作在火焰附近进行,耐热物品要经常在火焰上烧灼。金属器械烧灼时间不能太长,以免退火,且冷却后才能夹取组织。吸取过营养液的用具不能再烧灼,以免烧焦形成碳膜。
6. 操作动作要准确敏捷,但又不能太快,以防空气流动,增加污染机会。
7. 不能用手触及消毒器皿的工作部分,工作台面上的用品摆放要布局合理。
8. 瓶子开口后要尽量保持45°斜位。
9. 吸溶液的吸管等不能混用。
 
 
 
 
本文转自丁香园