细胞自噬过程的观察和检测方法

细胞生物学专家 2019年3月6日

标签: 细胞自噬 自噬体 荧光显微镜
细胞自噬过程的观察和检测可应用于:(1)研究细胞防御和应激调控机制;(2)自噬体膜的来源问题研究。(3)细胞器自噬研究。
工具药、融合蛋白等示踪自噬形成
实验方法原理
正常培养的细胞自噬活性很低,不适于观察,因此,必须对自噬进行人工干预和调节,包括自噬诱导剂、自噬抑制剂等工具药,以及反义RNA干扰技术(Knockdown)、突变株筛选、外源基因导入等。并通过荧光显微镜或者Western Blot等技术来检测。
 
实验材料:
细胞
试剂、试剂盒
自噬诱导剂
自噬抑制剂
单丹磺酰尸胺(MDC)
0.1%SDS
仪器、耗材:
荧光显微镜
细胞爬片
 
实验步骤
一、正常培养的细胞自噬活性很低,不适于观察,因此,必须对自噬进行人工干预和调节
二、细胞经诱导或抑制后,需对自噬过程进行观察和检测,常用的策略和技术有:
1、观察自噬体的形成;
2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成;
3、利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成;
4、检测长寿蛋白的批量降解;
5、MDC(Monodansylcadaverine,单丹磺酰尸胺)染色;
6、CellTrackerTM Green染色:主要用于双染色,但其能染所有的液泡,故也属于非特异性的;
 
注意事项
一、自噬诱导剂
1.Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin :模拟内质网应激
2.Carbamazepine/ L-690,330/ Lithium Chloride(氯化锂):IMPase 抑制剂(即Inositol monophosphatase,肌醇单磷酸酶)
3.Earle's平衡盐溶液:制造饥饿
4.N-Acetyl-D-sphingosine(C2-ceramide):Class I PI3K Pathway抑制剂
5.Rapamycin:mTOR抑制剂
6.Xestospongin B/C:IP3R阻滞剂
二、自噬抑制剂
1.3-Methyladenine(3-MA):(Class III PI3K) hVps34 抑制剂
2.Bafilomycin A1:质子泵抑制剂
3.Hydroxychloroquine(羟氯喹):Lysosomal lumen alkalizer(溶酶体腔碱化剂)
除了选用上述工具药外,一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预:包括反义RNA干扰技术(Knockdown)、突变株筛选、外源基因导入等。
 
其他
在研究自噬相关蛋白时,需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切,为了区别,常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位:
Lamp-2:溶酶体膜蛋白,可用于监测自噬体与溶酶体融合。
LysoTrackerTM 探针:有红或蓝色可选,显示所有酸性液泡。
pDsRed2-mito:载体,转染后表达一个融合蛋白(红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号),可用来检测线粒体被自噬掉的程度(Mitophagy)。
MitoTraker探针:特异性显示活的线粒体,荧光在经过固定后还能保留。
Hsp60:定位与线粒体基质,细胞死亡时不会被释放。
Calreticulin(钙网织蛋白):内质网腔
(注意:这些蛋白均为胞浆蛋白,爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜(permeablize),可采用0.1%SDS处理。)



本文转自丁香园