流式细胞术间接免疫荧光标记的样品制备实验
 
细胞生物学专家 2019年3月27日
 
标签: 流式细胞术 间接 免疫荧光标记 制备
 
主要用于科研样品的检测。
流式细胞术间接免疫荧光标记的样品制备实验
 
实验方法原理:
取一定量的细胞悬液,先加入特异的第一抗体,待反应完全后洗去未结合抗体,在加入荧光标记的第二抗体,生成抗原-抗体复合物,以流式细胞仪检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。

实验材料:
实验样品
 
试剂、试剂盒:
抗体、PBS溶液
 
仪器、耗材:
移液器
移液吸头
离心机
 
实验步骤:
一、不同来源样品的处理
1 . 培养细胞
(1)培养细胞用0.25%的胰酶消化。
(2)PBS或生理盐水洗涤细胞2次,再用PBS或生理盐水悬浮细胞,加入预冷的无水乙醇,终浓度为60%——70% ,快速混匀,并用封口膜封口,置4℃下可保存15天左右。
2. 新鲜标本
(1)将标本切成1——2mm3的小块。
(2)PBS或生理盐水清洗后去除上清,加入0.2%胶原酶(或0.15%胰蛋白酶)37℃消化10——30min(根据实验及不同组织确定),并不断振动。
(3)300目尼龙筛过滤,除去组织团块,PBS洗涤2次,300g离心5min,获得已消化的细胞。
3. 石蜡包埋标本
(1)标本在切片机上切取3——5片50μm厚的组织片。
(2)将切片彻底脱蜡,梯度乙醇(100%、95%、70%)及蒸馏水水化。
(3)0.5%胃蛋白酶(或胰蛋白酶)37℃消化30min,每隔10min振动1次。
(4)300目尼龙筛过滤,获得的细胞悬液PBS洗涤2次,300xg离心5min。
注意:脱蜡一定要完全(若加入100%乙醇无絮状物飘起即可);切片厚薄适宜,太薄碎片多,影响FCM分析结果,太厚易造成脱蜡不净;注意掌握消化时间,避免已释放的细胞被消化。
二、制备
1. 取1×106个细胞/100μl,先加入一抗混匀,置室温下避光反应30min。
2. 用PBS洗涤细胞2次,离心沉淀弃掉上清液(离心转数一般为800——1000rpm,5min)。
3. 用100μl PBS重悬细胞,再加入FITC或PE标记荧光二抗(用量均按说明书要求加入)混匀,室温下反应30min。
4. 用PBS再洗涤细胞2次,加入500μl PBS重悬成单细胞悬液,上机检测。
 
注意事项:
1. 以上两种染色方法的抗体加入量和反应时间,一般根据试剂使用说明书的要求进行。若说明书上未说明,应先进行预实验,掌握好剂量与最佳反应时间后,再进行流式样品的制备。
2. 制备好的样品,若不能及时上机检测,用1%——4%的多聚甲醛固定,4℃下可保存5天。

其他:
此法由于二抗一般为多克隆抗体,特异性较差,非特异性荧光背景较强,易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。此外,由于间标法步骤较多,增加了细胞的丢失,不适用测定细胞数较少的标本。



本文转自丁香园