细胞活性检测,您get了几个呢?


细胞生物学专家 2019年7月26日


小编前阵子去学了CPR,第一个步骤就是要先确认倒在那里的人是不是还…活着。
“先生先生,你怎么了?”(拍拍肩膀)

让小编开始好奇,我的细胞“要怎么判断他们是死是活呢?它们活的好吗?”

我们可以简单将分析细胞活力和增殖测定的方法分成5大类:

1.   代谢增殖测定

2.   DNA合成增殖试验

3.   化学发光细胞活性测定

4.   荧光染料增殖试验

5.   台盼蓝细胞计数

以下简单介绍这些分类的几种常见实验方式吧!(所有图片可点击放大)

 

代谢增殖测定

 

MTT检测法


活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶,能使额外添加的MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan),并沉积在细胞中,死细胞则无此现象。接着用二甲基亚砜(DMSO)溶解沉积在细胞中的甲瓒后,可利用酶标仪490nm波长测光吸收值,依据吸光值(OD值)计算出活细胞数量。在一定细胞数范围内,吸光值与细胞活性成正比(下图1)。

∆ 图1

 

XTT检测法

 

与MTT原理相似,皆是利用添加物与活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶反应,并利用酶标仪测定产物光吸收值;不同于MTT法的是,XTT法还原产物是水溶性的橙黄色甲肷,不需经过二甲基亚砜(DMSO)溶解步骤,即可直接测定光吸收值(BI,货号:20-300-1000),操作较MTT方便快速。当XTT与电子耦合剂作用后产生的水溶性甲肷吸光值与活细胞数成正比(下图2)。

∆ 图2

 

 

DNA合成增殖试验

 

BrdU检测法

 

BrdU为胸腺嘧啶核苷(Thymine)的衍生物,可用于标记活细胞中新合成的DNA(细胞活性周期S期),BrdU可随着DNA复制进入子细胞,因此在加入BrdU后分裂增殖的细胞DNA都会带有BrdU标记,可通过抗BrdU单克隆抗体检测,借此检测细胞的增殖能力,但BrdU单克隆抗体检测过程需要将部分DNA变性,使部分双股解开成单股才能顺利检测(下图3)。且BrdU为光敏性,因此需要在光线刺激较低(黑暗)的环境下操作,并避光培养。

∆ 图3

 

EdU检测法

 

EdU原理跟BrdU检测法很像,都是代替胸腺嘧啶(Thymine, T)渗入正在复制的DNA中,并加入能与Edu反应的荧光染料,即可利用检测荧光值侦测应用于细胞增殖,或在细胞组织级别作为标记追踪等研究(下图4),实验过程不需要经过BrdU检测法的DNA变性处理。

∆ 图4

 

 

化学发光细胞活性测定

 

ATP发光法

 

ATP是细胞的能量直接来源,ATP发光法是藉由检测细胞内ATP含量来分析细胞增殖。市面上的原理是利用外源的萤火虫荧光素(Luciferin)与荧光素酶(Luciferase),以细胞内含的ATP为能量来源,发生氧化反应产生生物冷光,因此可通过监测冷光光度,来对应ATP含量并判断细胞增殖状况(下图5)

∆ 图5

 

 

荧光染料增殖试验

 

CFSE检测法

 

CFSE是一种可穿透细胞膜的荧光染料,具有细胞膜通透性,能够自由进入细胞;当CFSE扩散穿过细胞膜,会与细胞内源酯酶产生水解反应而被激发,发出绿色荧光,这些带荧光的CFSE会进一步与细胞骨架蛋白结合,形成稳定的胞内荧光蛋白。每当细胞进行分裂增殖,胞内荧光蛋白会被平均分配到下一代细胞中,因此细胞荧光强度会随着增殖代数增加而不断地降低(下图6),可用流式细胞仪进一步侦测分析得出细胞分裂增殖的情况。CFSE的浓度,对于最终判断细胞增殖结果有直接性的影响!

∆ 图6

 

 

台盼蓝细胞计数

 

台盼蓝(Trypan Blue)计数法

 

台盼蓝(BI,货号:03-102-1B)是一种蓝色细胞活性染料,无法通过结构完整的细胞膜进入细胞内部;但细胞死后,丧失细胞膜稳定性,台盼蓝会进入细胞将细胞染成蓝色,因此在细胞实验中,被常规地搭配自动细胞计数仪或血球计数板,应用于区分辨活细胞和死细胞、及检测细胞膜的完整性(如下图7)。

∆ 图7

 

 

 

 

THE END

 

当然,随着科技的日新月异,会有越来越多更精确的实验方法等着大家去学习研究。
您实验室都在用什么方法测定细胞活性呢? 快在下面留言跟我们分享噢!

阅读原文请点击:原文链接

 

 

Reference

  • 参考网站:http://tinyurl.com/yyhapr9x

  • Riss, Terry L., et al. "Cell viability assays." Assay Guidance Manual [Internet]. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences, 2016.

本文转自逍鹏生物