多能干细胞PSC培养,这些技巧get了吗?

细胞生物学专家2019年10月18日

提到多能干细胞(PSC)培养,
经常会遇到诸如此类不省心的事儿
。。。。

那么关于PSC传代培养、冻存、复苏及基质使用都有什么技巧和要点?
这次我们继续就广大用户遇到的困难,用心总结
快把你们的眼神转过来!
自由选择板凳,沙发,还是躺床上涨姿势
此外若仍有疑问,欢迎大家积极发言!!!
(可在文章下方留言或私信)



无血清培养基   

PSC培养通常推荐使用无血清培养基,
比如,BI NutriStem® hPSC无血清培养基。
支持hESC及iPSC快速贴壁并大量增殖,bFGF和TGFβ因子浓度更低,不干扰细胞代谢,不刺激细胞分化。
并且适用于临床,已获得美国FDA二类原料药证号,DMF NO:30984

    hPSC传代    
 
何时开始传代培养?
1. 滋养层细胞老化
2. 细胞集落太密或细胞停滞增长
3. 细胞集落已经有合并的现象
4. 细胞集落开始堆积或分化
 
完全培养基的准备
1. 冻存的 NutriStem®  hPSC XF在室温或2-8℃解冻,避免反复冻融,解冻的培养基可以存储2-8°C,2周内使用完毕。
2. 如果需要较小的数量,以无菌技术配制成等份,避免反复冻融。
3. NutriStem® hPSC XF使用前必须回温至15°C-30°C,为确保培养基的稳定性,只需回温所需的量,贮藏时避免照光。
 
如何做好传代培养?
1. 以6孔板滋养层培养为例,吸除孔板内的培养基,每孔加入1.0 ml胶原酶溶液。
2. 放置在37°C或室温,直到细胞集落从孔板的边缘开始松动(孵育的时间,在细胞株和细胞聚落大小之间会有所不同)。一般孵育3分钟后开始检查细胞集落,勿孵育时间过长,hPSC细胞对胶原酶比较敏感,容易从孔板脱落。
3. 吸去分离液,用2ml无菌培养基DMEM/F-12 (1:1)轻洗两次。
4. 加入1ml培养基,用5ml移液管轻轻将脱落hPSC细胞从孔板内吹打下来,谨慎吸出上清至离心管,不要吸到滋养层细胞。
5. 在室温以800rpm离心3~5min。
6. 吸除上清,加入NutriStem®  hPSC XF培养基,用5ml移液管轻轻将细胞团打散,将细胞接种至有滋养层细胞孔板中,加入2.5~3.0ml NutriStem® hPSC XF培养基,放入37℃,5% CO2培养箱内培养。
7.每天更换一次2.5~3.0ml新的NutriStem® hPSC XF培养基
 
关于细胞传代比例
保持细胞的传代比率很重要,
生长较慢的细胞按1:4传代,生长较快的按1:8传代

 
    基质的使用  
 
无滋养层细胞培养,建议使用层粘连蛋白LN521。
在LN521上,hPSCs细胞以单细胞形式接种,生长成为均质的单细胞层,无自然分化,也无须使用凋亡抑制剂。
细胞约在4至6天内达到融合,并扩增10至25倍,周末也无须进行换液
 
层粘连蛋白包被
层粘连蛋白涂层包被,包被浓度0.5-1μg/cm2(一般包被 0.5μg/cm2),以下以6孔板为例:
1. 在2-8°C缓缓解冻层粘连蛋白(重组LN521)。
2. 用含钙镁的DPBS稀释LN521至5ug/ml
3. 每孔加入2ml稀释好的LN521。
4. 密封培养器皿(如使用parafilm® 膜)防止蒸发,在2-8°C孵育过夜,确保层粘连蛋白溶液均匀分布在表面。避免表面干燥,以免层粘连蛋白失活。

在LN521上培养hPSC细胞
1. 以6孔板滋养层培养为例,每孔加入适量DPBS (2ml/well 不含钙离子和镁离子)轻轻冲洗1次,每孔加入1.0ml重组胰酶-EDTA,覆盖整个细胞表面,在37°C 作用 2~4min(勿在EDTA孵育时间过长)。
2. 加入4.0ml的1xSBTI ,中和重组胰酶-EDTA,并将细胞吹打下来。谨慎收集细胞悬液到离心管中, 200xg离心5min。
3. 离心后,弃上清液,用1.0ml完全培养基悬浮后,混匀细胞悬液。台盼蓝1:1混匀,计数细胞。
4. 将细胞接种至层粘连蛋白包被培养器皿中,加入3.0-4.0 ml培养基,10-20,000 /cm2细胞密度,培养约4-5天。
5. 在37℃,5%CO2培养箱内培养,48小时内不要移动孔板(会促进分裂后细胞分化)。每天更换一次新的NutriStem® hPSC XF培养基,2.5~3.0ml。48小时后达到最佳培养密度,4-6天后,大多数细胞达到倍增10-25倍。
 
关于细胞冻存和复苏,我们已经总结过,
BI教您如何做好细胞冻存与复苏?
看过的童鞋可以再复习一遍,看看是否真正掌握!

细胞冻存
 
若是贴壁细胞,请先将细胞消化下来;若是悬浮细胞,请直接按以下步骤进行:
1. 以200-300g离心3分钟,弃去上清,收集细胞。
2. 用BI无血清冻存液将细胞重悬(不需回温),将细胞密度调整为3~5x106
cells/ml,添加到冻存管中(一般每管1ml)。
3. 建议将含有细胞悬液的冻存管放进程序降温盒或是保温杯中,置于-80°C冰箱6小时以上或是过夜(或不需要程序降温)。
4. 将冻存管迅速移到液罐氮中保存。
5. 冻存24小时后,建议检测细胞存活率。
细胞复苏
 
1. 将细胞冻存管由液罐氮中取出,置于室温回温,不用水浴溶解。此时可准备新鲜培养   基、无菌15ml离心管、培养瓶等。
2. 在生物安全柜内,直接以少量培养基反复冲融,使细胞团块化冻。
3. 先在15ml无菌离心管中加入5ml培养基,再将化冻的细胞悬液加入离心管中。以200~300g,3分钟离心收集细胞。

4. 倒去上清液,重悬细胞,移到培养瓶中培养。